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　　紅細(xì)胞裂解液操作步驟

　　紅細(xì)胞裂解液操作步驟：

　　(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

　　1、取NP-40裂解液置于室溫融解混勻，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為1mM。

　　2、去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液清洗1次，低速離心，棄上清，留取沉淀。

　　3、按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的NP-40裂解液，移液器輕輕吹打，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。置于冰上或4℃裂解，通常裂解液作用于細(xì)胞1～3s內(nèi)，細(xì)胞就會被裂解。

　　4、10000～12000g，4℃離心5～10min(如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。

　　5、后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

　　(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

　　1、取NP-40裂解液置于室溫融解混勻，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。

　　2、低速離心懸浮細(xì)胞，棄上清，收集沉淀。

　　3、用手指輕彈細(xì)胞，使其松散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150～250μl含PMSF的NP-40 裂解液。如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200～250μl。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞，充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。

　　4、10000～12000g，4℃離心5～10min(如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。

　　5、進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

　　(三)組織樣本

　　1、把組織剪切成細(xì)小的碎片，越小越好。

　　2、取NP-40裂解液置于室溫融解混勻，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。

　　3、取在液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min 以上的組織，迅速研磨，研磨過程盡量控制在1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

　　4、按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液，冰上或4℃裂解30～60min。

　　5、步驟3、4亦可以采用如下過程：按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的NP-40裂解液。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿，直至充分裂解，該過程盡量控制在1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

　　6、10000～12000g，4℃離心5～10min(如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。

　　7、進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

　　裂解液注意事項(xiàng)：

　　1. 為取得佳的使用效果，盡量避免過多的反復(fù)凍融。建議將其適當(dāng)分裝成合適的量，然后置于-20℃保存。

　　2. 細(xì)胞裂解蛋白提取的所有操作步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。

　　3. 建議在臨用數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的終濃度為1mM。PMSF可以向我公司訂購。

　　4. 在貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的操作步驟中，去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液后，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗。

　　5. 如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。

　　6. 在培養(yǎng)細(xì)胞的裂解中，如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50~100萬細(xì)胞/離心管，然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。

　　7. 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強(qiáng)烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器或研磨設(shè)備，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器或研磨那樣裂解得比較充分。

　　8. 如果希望獲得更好的裂解效果，細(xì)菌和酵母可以分別使用溶菌酶和破壁酶消化，然后再使用本裂解液進(jìn)行裂解。

　　9. 復(fù)融后的試劑請及時使用，避免裂解液中有效成分失效。

　　10. 本產(chǎn)品僅限于業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

　　11.為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

　　裂解液本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴(yán)于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)，以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來。