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　　本生淺談熒光定量PCR管的實(shí)驗(yàn)原理及操作使用

　　熒光定量PCR管的實(shí)驗(yàn)原理：

　　實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是指同時(shí)監(jiān)測(cè)PCR過程的能力。因此，可以在PCR擴(kuò)增過程中收集數(shù)據(jù)，而不是在PCR后。這給基于PCR的DNA和RNA定量方法帶來了革命性的變化。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)中，反應(yīng)的特征是在循環(huán)中檢測(cè)到目標(biāo)擴(kuò)增的時(shí)間點(diǎn)，而不是在一定循環(huán)數(shù)后目標(biāo)分子的累積擴(kuò)增量。目標(biāo)核酸的初始拷貝數(shù)越高，熒光顯著增加的速度越快。相反，終點(diǎn)試驗(yàn)(也稱為“讀數(shù)板試驗(yàn)”)測(cè)量PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)PCR產(chǎn)物的累積量。

　　熒光定量PCR管的操作使用：

　　1、樣品制備

　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，向cDNA模板中加水進(jìn)行適當(dāng)稀釋，渦旋混合和離心，根據(jù)檢測(cè)到的樣本和基因的實(shí)際數(shù)量計(jì)算樣本添加系統(tǒng)，根據(jù)系統(tǒng)添加ddH2O、qPCRmix、引物，制備一管混合、渦旋混合、離心。準(zhǔn)備適量的qPCR八排板或96孔板。在這里，我們使用八排試管，將它們放在冰上進(jìn)行操作，然后將上一步中混合的混合物壓至19μL，每孔添加一μL到八排孔中。

　　2、增加模板

　　向每個(gè)孔添加1μLcDNA模板。添加樣品后，蓋住八排管蓋，并嘗試從孔邊緣壓縮管蓋。渦流混合和離心以去除氣泡。

　　3、計(jì)算機(jī)響應(yīng)

　　操作機(jī)器的程序設(shè)置如下：設(shè)置反應(yīng)溫度，設(shè)置孔板信息，將樣品放入儀器，開始反應(yīng)。

　　4、導(dǎo)出數(shù)據(jù)

　　反應(yīng)后，獲得qPCR數(shù)據(jù)。根據(jù)溶解曲線，檢查數(shù)據(jù)的有效性，將數(shù)據(jù)導(dǎo)出為Excel文件并保存。

　　5、實(shí)驗(yàn)結(jié)束

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，打開qPCR儀器，取出8根相連的試管，蓋上qPCR儀器并關(guān)閉計(jì)算機(jī)和儀器。

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