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　　BUNSEN本生簡述：做ELISA實驗需要注意哪些問題

　　1、ELISA操作準(zhǔn)備工作

　　試劑盒的選擇ELISA操作，應(yīng)做好實驗的設(shè)計、選擇適合自己檢測范圍和靈敏度的試劑盒、提訂購和準(zhǔn)備試劑及耗材、處理樣本等準(zhǔn)備工作。

　　樣本處理在收集標(biāo)本需有一個完整的計劃，需要清楚要檢測的成分是否足夠穩(wěn)定。ELISA檢測提倡新鮮標(biāo)本盡早檢測，對收集后當(dāng)天就進行檢測的標(biāo)本，及時儲存在4°C備用，如有特殊原因需要周期收集標(biāo)本，請取材后，將標(biāo)本及時分裝后放在-20C或-80C條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差，蛋白易降解，直接影響實驗質(zhì)量，所以避免反復(fù)凍融。

　　2、ELISA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋

　　標(biāo)準(zhǔn)品嚴(yán)禁反復(fù)凍融。標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋應(yīng)事先做好準(zhǔn)備，如離心管的準(zhǔn)備和編號以及稀釋液的準(zhǔn)備;稀釋時，應(yīng)充分混勻;采用進口或者硅化的EP管，減少蛋白吸附。在實驗孔內(nèi)進行倍比稀釋時，注意操作規(guī)范，槍頭勿刮劃預(yù)包被的孔底。

　　注意:@品牌試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品是已倍比稀釋好的，是即用型標(biāo)準(zhǔn)品。

　　3、ELISA操作中的洗滌

　　洗滌是ELISA實驗中是多次數(shù)的操作，也是非常重要的步驟。不嚴(yán)格的洗滌容易出現(xiàn)洗不干凈或交叉污染現(xiàn)象，實驗重復(fù)效果差的現(xiàn)象。

　　不管用多道加樣器、洗瓶、吸管，還是洗板機，嚴(yán)格按照說明書操作不要減少步驟洗滌的洗滌體積、洗滌時間和洗滌次數(shù)。注意標(biāo)準(zhǔn)化操作將減少實驗誤差和不同實驗之間的誤差。操作者常出現(xiàn)洗板不干凈現(xiàn)象，請比照“手工洗板小貼士”操。
 

　　a)洗液不要溢出孔外，以免污染相鄰的孔，特別是每次洗板的兩遍，若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定會增高。

　　b)特別注意:設(shè)計實驗的時候要考慮實驗孔的位置甩掉洗液時，空白孔、低濃度孔或陰性對照組在上面或一側(cè)或分開。同時注意甩掉洗液的動作翻轉(zhuǎn)(從正上方旋轉(zhuǎn)120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右搖擺、旋轉(zhuǎn)來甩液體!甩出后以直線方式補2-3次甩出液體。

　　c)用干凈的濾紙，不要用衛(wèi)生紙，因為細(xì)小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底，導(dǎo)致洗板不干凈，結(jié)果偏高或偏低，重復(fù)孔的數(shù)值也會相差很大。

　　d)每次拍板不要重復(fù)在一個地方拍，特別是洗去酶的步驟;拍板不宜過輕，否則拍不干凈，拍板很用力不會對蛋白有什么影響。但注意不要太重，以至把板條給拍斷。每次洗板后輕叩幾下，一次一定要扣干凈。

　　e)不能減少洗液體積、洗板時間和次數(shù)。洗板時間太短，洗板效果不佳。延長洗板時間和增加洗板次數(shù)可以使背景更干凈。

　　注：以上資料僅供參考!

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原創(chuàng)作者：本生（天津）健康科技有限公司