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　　PCR擴增實驗中經(jīng)常出現(xiàn)的問題及解決辦法

　　在進行PCR擴增時，京城會遇到一些問題，需要改變各種影響PCR擴增的參數(shù)及條件，以改善反應產(chǎn)物的常量和特異性。

　　1、沒有得到所希望的PCR擴增產(chǎn)物。

　�、俅_定是加入酶，檢查酶是否具有活性。

　　②DNA分子解鏈是否充分。

　�、奂尤氲娜斯ず铣梢�物是否爭取。

　　④在未加入Taq DNA聚合酶之，將反映系統(tǒng)放置在95℃保溫5-10分鐘，以使蛋白酶及核酸酶失去活性。

　　2、PCR擴增產(chǎn)物在凝膠電泳中呈片狀。

　�、贉p少Taq DNA聚合酶的濃度。

　　②增加退火的溫度

　�、劢档蚆g++的濃度。

　�、軠p少擴增循環(huán)周期次數(shù)。

　　⑤減少退火及延伸的時間。

　　⑥從凝膠中回收與所希望的段大小相同的DNA,再次進行PCR擴增。

　　3、凝膠電泳中出現(xiàn)引物二聚體區(qū)帶

　�、贆z查引物的3`-端是否互補。

　�、谠O計較長的引物。

　�、墼黾影心繕薉NA的量。

　�、芙档鸵�物的濃度。

　�、轀p少擴增循環(huán)周期次。

　�、拊黾油嘶鸬臏囟�

　　4、PCR擴增產(chǎn)物特異性不夠

　　①增加退火的溫度。

　�、跍p少退火及延伸時間。

　�、劢档鸵�物和Taq DNA聚合酶的濃度。

　�、芨淖僊g++的濃度

　　預防PCR擴增中污染的措施：

　　1、擴增所用的試驗要少量分裝保存，為一次實驗的使用。

　　2、實驗中實驗人員要穿工作服、戴手套，尤其是RT-PCR擴增的過程中必須戴手套。

　　3、實驗中加取標本和反應試劑要迅速、準確、盡量減少標本取樣的次數(shù)，并就近操作，避免遠距離一樣，陽性對照加入。

　　4、PCR擴增實驗中所使用的要用，不可竄用。

　　5、實驗中使用的加樣頭，標本處理和擴增用的離心管要高壓滅菌消毒。

　　6、加權(quán)樣本和擴增產(chǎn)物時，不要反復抽吸和空吸，避免產(chǎn)生氣溶膠，污染實驗室。

　　7、要嚴格執(zhí)行先加入反映實際，后加入標本DNA。

　　8、擴增過程中的流程要有次序，避免已經(jīng)入下步驟的擴增標本，返回到一步驟，造成污染。

　　PCR擴增過程中污染的主要來源

　　核算擴增是一項很有效的技術(shù)，但同時優(yōu)勢很靈敏的方法以至于很容易出現(xiàn)假陽性的反應，這種假陽性反應的干擾主要產(chǎn)生于3個方面

　　1、應用DNA質(zhì)粒作為核算擴增反應的陽性對照。

　　2、DNA由林勇標本，培養(yǎng)物或由被污染的試劑延續(xù)下來。

　　3、擴增DNA的污染(即PCR產(chǎn)物)。

　　PCR擴增產(chǎn)物污染的主要排出方法：

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原創(chuàng)作者：本生（天津）健康科技有限公司