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　　技術(shù)資料| 本生實驗 夾心法ELISA操作步驟
 

　　ELISA實驗操作步驟

　　1、分別設(shè)定標準孔、0孔和樣本孔，計算好當(dāng)次試驗所需要的板條數(shù)量，將不需要的板條拆卸下來，用新的封板膜重新封好，放回裝有干燥劑的鋁箔袋。

　　2、浸泡酶標板：加入300 μL 1×洗滌液靜置浸泡30，棄掉洗滌液之后，在吸水紙上將微孔板拍干，重復(fù)2次。

　　提示：洗板完成之后，請立即使用微孔板，不要讓微孔板干燥。

　　3、加標準品：標準品孔加入100 μL的2倍倍比稀釋的標準品。0孔加入100 μL標準品/樣本稀釋液。

　　4、加樣本：樣本孔加入100 μL的待測樣本。連續(xù)加樣，不要間斷。加樣過程在10 min內(nèi)完成。

　　5、孵育：使用新的封板膜封板。37℃靜置孵育90 min。

　　6、洗滌：棄掉液體，每孔加入300 μL洗液洗板，洗滌4次。每次洗板，在吸水紙上拍干。

　　提示：為獲得理想的實驗結(jié)果，必須干凈移除殘留液體。洗板完成之后，請立即進行下步操作，不要讓微孔板干燥。

　　7、加生物素化檢測抗體：加入100 μL生物素化抗體工作液至反應(yīng)孔中。

　　8、孵育：使用新的封板膜封板。37℃靜置孵育60 min。

　　9、洗滌：棄掉液體，每孔加入300 μL洗液洗板，洗滌4次。每次洗板，在吸水紙上拍干。

　　提示：為獲得理想的實驗結(jié)果，必須干凈移除殘留液體。洗板完成之后，請立即進行下步操作，不要讓微孔板干燥。

　　10、加酶結(jié)合物：加入100 μL酶結(jié)合物工作液至反應(yīng)孔中。

　　11、孵育：使用新的封板膜封板。封板后于37℃靜置孵育30 min。

　　12、洗滌：棄掉液體，每孔加入300 μL洗液洗板，洗滌5次。每次洗板，在吸水紙上拍干。

　　提示：為獲得理想的實驗結(jié)果，必須干凈移除殘留液體。洗板完成之后，請立即進行下步操作，不要讓微孔板干燥。

　　13、加底物顯色：每孔加入100 μL顯色底物TMB，避光，37℃避光顯色15 min。

　　提示：可根據(jù)實際顯**況酌情縮短或延長顯色時間，但不可超過30 min。當(dāng)標準孔顏色出現(xiàn)明顯梯度時(標準孔的4孔出現(xiàn)明顯的藍色梯度，后3~4孔不明顯)，即可終止。提15 min打開酶標儀預(yù)熱。

　　14、加終止液：每孔加入50 μL終止液，終止液加入的順序應(yīng)盡量與顯色底物加入的順序相同。

　　提示：終止液加入后微孔板內(nèi)液體的顏色由藍色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均勻，請輕輕叩擊板框，水平充分混勻。

　　15、檢測讀數(shù)：在5 min之內(nèi)，使用酶標儀進行雙波長檢測，測定450 nm吸收波長和630 nm參考波長下的OD值。

　　提示：校準后的OD值為450 nm的測定值減去630 nm的測定值。(注：630 nm OD值為酶標板材質(zhì)吸收值。若不能進行雙波長檢測，可只測定450 nm波長下的OD值，但數(shù)據(jù)的準確度會降低一些)

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