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　　知識(shí)大全：細(xì)胞常見問題解答

　　01、細(xì)胞培養(yǎng)過程中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有哪些?

　　答：MEM、DMEM、F12K、DMEM/F12、α-MEM、PRMI1640、L-15、McCoy’s5A等。

　　02、儲(chǔ)存在冰箱中的培養(yǎng)基，在放置幾天后顏色變紫是什么原因?

　　答：培養(yǎng)基保存在4℃條件下，培養(yǎng)基內(nèi)的CO2會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性，而培養(yǎng)基中酸堿指示劑(通常為酚紅)的顏色也會(huì)隨著堿性增加而偏紫。培養(yǎng)基偏堿性將會(huì)造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡�？梢栽谑褂眯�松瓶蓋(用于培養(yǎng)箱與培養(yǎng)基瓶中氣體交換)，在CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)基10-15分鐘，來校正溶液PH值。

　　03、血清中可能出現(xiàn)的沉淀物是什么?

　　1)纖維蛋白。它是經(jīng)常出現(xiàn)的較大的沉淀物，可以達(dá)到1-2mm，可以用肉眼觀察到。

　　2)磷酸鈣。它也是常見的一種沉淀物，通常會(huì)使血清出現(xiàn)渾濁，并且在37℃培養(yǎng)的時(shí)候會(huì)增加。這種沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像小黑點(diǎn)，這些小黑點(diǎn)由于布朗運(yùn)動(dòng)看上去可以活動(dòng)，因此常被誤認(rèn)為是微生物污染。

　　3)膽固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白質(zhì)。它們也是血清中出現(xiàn)沉淀物的常見原因。

　　04、什么是熱滅活，有必要作熱滅活嗎?

　　答：熱滅活是指以56℃，30分鐘水浴處理已經(jīng)解凍的血清，使血清中的補(bǔ)體滅活。以往公認(rèn)的操作中，培養(yǎng)的血清通常是經(jīng)過熱滅活的，但是并沒有確鑿的證據(jù)說明這樣做是有益的，雖然滅活有可能降低支原體的滴度，但滅活能夠消除支原體的論點(diǎn)還不能算是成立。另外，經(jīng)過滅活的血清，顆粒狀沉淀物會(huì)顯著增加。

　　建議：若非必須，不要對(duì)血清進(jìn)行熱滅活。不斷可以節(jié)約時(shí)間，而且確保血清的質(zhì)量。

　　05、細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢是什么原因?

　　1)生長(zhǎng)培養(yǎng)基使用不當(dāng);建議按照生產(chǎn)商的建議，使用與細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基。

　　2)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中血清質(zhì)量差;建議更換其他品牌或者其他批次的血清。

　　3)傳代操作不當(dāng);按照生產(chǎn)商的建議消化時(shí)間及傳代比例進(jìn)行操作。

　　4)換液過于頻繁;降低換液頻率，參考生產(chǎn)商推薦的換液頻率。

　　5)細(xì)胞生長(zhǎng)超過匯合狀態(tài);哺乳動(dòng)物細(xì)胞傳代應(yīng)在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)其、未達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行，建議密度80%傳代。

　　6)細(xì)胞狀態(tài)不佳，傳代次數(shù)過多;使用傳代次數(shù)較少的健康細(xì)胞。

　　7)支原體污染;棄掉原有細(xì)胞及培養(yǎng)基，重新復(fù)蘇代數(shù)比較低的細(xì)胞。

　　06、細(xì)胞復(fù)蘇后存活率低是什么原因?

　　1)細(xì)胞凍存不當(dāng);先要確保凍存細(xì)胞細(xì)胞的狀態(tài)良好，嚴(yán)格按照生產(chǎn)商推薦的操作程序凍存細(xì)胞，凍存過程中液氮灌中液氮充足，不在冰箱里面存放細(xì)胞。

　　2)復(fù)蘇方法不當(dāng);嚴(yán)格按照生產(chǎn)商推薦的操作程序復(fù)蘇細(xì)胞，確保冷凍細(xì)胞解凍迅速。

　　3)處理細(xì)胞時(shí)動(dòng)作不夠輕柔;凍存和復(fù)蘇過程對(duì)大多數(shù)細(xì)胞會(huì)造成不利影響，應(yīng)進(jìn)行低速離心。

　　4)凍存液中保護(hù)劑存儲(chǔ)不當(dāng);沒有避光細(xì)胞凍存保護(hù)劑會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)細(xì)胞有毒性的物質(zhì)，應(yīng)及時(shí)更換。

　　07、培養(yǎng)基PH值變化迅速是什么原因?

　　1)培養(yǎng)箱CO2分壓設(shè)置錯(cuò)誤，根據(jù)培養(yǎng)基中的NaHCO3的濃度增大或降低培養(yǎng)箱CO2的分壓，NaHCO3濃度為2.0-3.7g/l時(shí)，應(yīng)相應(yīng)地使用5%-10%的CO2分壓。

　　2)細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶蓋過緊將瓶蓋旋松1/4圈。

　　3)碳酸氫鈉緩沖系統(tǒng)緩沖能力不足，加入HEPES緩沖液，使其終濃度為10-25mM。

　　4)細(xì)菌、酵母或者真菌污染，將細(xì)胞和培養(yǎng)基滅菌處理后丟棄。

　　08、微生物污染有那些獨(dú)有的特點(diǎn)?

　　1)PH突然改變，細(xì)菌污染的大多數(shù)情況是PH降低，酵母污染時(shí)PH很少改變，只有在污染嚴(yán)重時(shí)PH才會(huì)改變。真菌污染有時(shí)會(huì)出現(xiàn)PH上升。

　　2)培養(yǎng)基出現(xiàn)云霧狀，有時(shí)表面出現(xiàn)片層或者泡沫狀，或在生長(zhǎng)表面出現(xiàn)點(diǎn)狀物，當(dāng)移動(dòng)培養(yǎng)瓶時(shí)它們會(huì)消失。

　　3)細(xì)菌污染時(shí)，在低倍鏡下(約100倍)可見細(xì)胞之間的空隙處有細(xì)沙狀的顆粒物。酵母污染則顯示有分散的圓形或卵形的顆粒，并可能出芽長(zhǎng)出更小的顆粒，真菌污染會(huì)產(chǎn)生細(xì)的纖維狀菌絲體或有時(shí)產(chǎn)生密集的孢子，隨著毒性加重，細(xì)胞壞死越來越明顯。

　　4)在高倍鏡下(約400倍)，有可能分辨出細(xì)菌個(gè)體，并可區(qū)分出桿菌或球菌。

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