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　　人低密度脂蛋白(LDL)檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

　　人低密度脂蛋白(LDL)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理:

　　本試劑盒采用雙抗體夾心法：抗人低密度脂蛋白(LDL)單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的低密度脂蛋白(LDL)會(huì)與單抗結(jié)合，游離的成份被洗去。加入酶標(biāo)抗體，抗人低密度脂蛋白(LDL)抗體與結(jié)合在單抗上的人低密度脂蛋白(LDL)結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應(yīng)孔中有低密度脂蛋白(LDL)，辣根過(guò)氧化物酶會(huì)使無(wú)色的顯色劑現(xiàn)藍(lán)色，加終止液變黃。在450nm處測(cè)OD值，低密度脂蛋白(LDL)濃度與OD450值之間呈正比，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中的低密度脂蛋白(LDL)濃度。

　　選用生產(chǎn)廠家的原料，采用業(yè)體外診斷試劑生產(chǎn)技術(shù)制造。適用于體外定量檢測(cè)人血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中天然重組人低密度脂蛋白(LDL)濃度。僅供科研使用，使用請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)并檢查試劑組分。

　　人低密度脂蛋白(LDL)檢測(cè)試劑盒組成：

　　中文名稱(chēng)英文名稱(chēng)規(guī)格保存

　　ELISA酶標(biāo)板(可拆卸)Micro ELISA Plate(Dismountable)8×12 / 8×6*4℃/-20℃ #

　　凍干標(biāo)準(zhǔn)品Reference Standard2/1 支*4℃/-20℃ #

　　標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液Reference Standard & Sample Diluent1瓶 20mL/12mL*4℃

　　濃縮生物素化抗體Concentrated Biotinylated Detection Ab1支 120μL/70μL*4℃/-20℃ #

　　生物素化抗體稀釋液Biotinytated Detection Ab Diluent1瓶 10mL/6mL*4℃

　　濃縮HRP酶結(jié)合物Concentrated HRP Conjugate1支 120μL/70μL*4℃(避光)

　　酶結(jié)合物稀釋液HRP Conjugate Diluent1瓶 10mL/6mL*4℃

　　濃縮洗滌液(25×)ConcentratedWashBuffer (25×)1瓶 30mL/16mL*4℃

　　底物溶液(TMB)Substrate Reagent1瓶 10mL/6mL*4℃(避光)

　　反應(yīng)終止液S Solution1瓶 10mL/6mL*4℃

　　封板覆膜Plate Sealer5/3 張*

　　人低密度脂蛋白(LDL)檢測(cè)試劑盒樣品收集:

　　1. 血清：全血樣品于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，收集血液的試管應(yīng)為一次性的無(wú)熱原，無(wú)內(nèi)毒素試管。

　　2. 血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)。避免使用溶血，高血脂樣品。

　　3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)

　　影響測(cè)量結(jié)果)，稱(chēng)重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè)。

　　4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測(cè)。

　　5. 其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)

　　6. 樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

　　7. 樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個(gè)月內(nèi)檢測(cè))，或-80℃(6個(gè)月內(nèi)檢測(cè))，避免反復(fù)凍融。

　　8. 如果您的樣品中檢測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù))。

　　試驗(yàn)所需自備物品:

　　1. 酶標(biāo)儀(450nm波長(zhǎng)濾光片)

　　2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

　　3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水

　　4. 吸水紙

　　人低密度脂蛋白(LDL)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)準(zhǔn)備工作:

　　1. 請(qǐng)?zhí)?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

　　2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正�，F(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶溶解后再配制洗滌液(加熱溫度不要超過(guò)50℃，使用時(shí)洗滌液應(yīng)為室溫)。當(dāng)日使用。

　　3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 于10000×g離心1分鐘，加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，旋緊管蓋，靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻(濃度為50ng/mL。)。然后根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋(注：不要直接在反應(yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋)。建議配制成以下濃度：按照稀釋方法圖例 標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/mL。如配制5ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5mL10ng/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5mL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類(lèi)推。

　　4. 生物素化抗體工作液：實(shí)驗(yàn)計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量(以100μL/孔計(jì))，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制100-200μL。使用15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作濃度。當(dāng)日使用。

　　5. 酶結(jié)合物工作液：實(shí)驗(yàn)計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量(以100μL/孔計(jì))，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制100-200μL。使用15分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。

　　當(dāng)日使用。

　　標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例：(以500μL/管為例，也可根據(jù)實(shí)際用量來(lái)稀釋?zhuān)��?00μL/管)

　　洗滌方法:

　　任何一個(gè)成功的ELISA檢測(cè)，正確的洗板方法是非常關(guān)鍵和重要的一方面。連貫的洗板也很有必要的。在稀釋濃縮洗滌液時(shí)，請(qǐng)使用去離子水或者蒸餾水。

　　◆ 洗滌瓶或多通道移液器

　　洗瓶?jī)?nèi)壓強(qiáng)良好或者移液器的管頭被適當(dāng)調(diào)整并且無(wú)碎屑。檢查板內(nèi)的板條是否安好。將板條編號(hào)以防在傾泄的時(shí)候松動(dòng)便于調(diào)整。先，傾泄酶標(biāo)板以清空內(nèi)容物。根據(jù)試劑盒內(nèi)推薦的體積向每孔內(nèi)滴加洗液。若實(shí)驗(yàn)步驟中要求浸泡，則定時(shí)將每孔浸泡。將板內(nèi)液體傾倒，用干凈紙巾擦拭。按照說(shuō)明書(shū)所示重復(fù)以上步驟。一次洗板之后，將板內(nèi)液體傾倒，用干凈紙巾拍打表面并擦干。切勿讓孔內(nèi)干燥。按照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)迅速進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。

　　◆ 自動(dòng)洗板儀

　　將自動(dòng)洗板儀接入適當(dāng)真空(根據(jù)制造商的說(shuō)明)。確保每管都被適當(dāng)抽吸。先，通過(guò)吸或者傾倒將板清空。根據(jù)試劑盒內(nèi)推薦的體積向每孔內(nèi)滴加洗液。若實(shí)驗(yàn)步驟中要求浸泡，則定時(shí)將每孔浸泡。抽吸各孔，沒(méi)有洗液殘留。在孔內(nèi)液體被抽走之后不要再將裝置至于孔內(nèi)過(guò)分抽吸。按照說(shuō)明書(shū)所示重復(fù)以上步驟。一次洗板之后，將板內(nèi)液體傾倒，用干凈紙巾拍打表面并擦干。切勿讓孔內(nèi)干燥。按照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)迅速進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。

　　操作步驟:

　　實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，各試劑均應(yīng)平衡至室溫;試劑或樣品配制時(shí)，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

　　1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液 100μL，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品 100μL，注意不要有氣泡，加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育 90 分鐘。為實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

　　2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每個(gè)孔中加入生物素化抗體工作液 100μL(在使用15 分鐘內(nèi)配制)，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育 1 小時(shí)。

　　3. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。

　　4. 每孔加酶結(jié)合物工作液(臨用 15 分鐘內(nèi)配制)100μL，加上覆膜，37℃溫育30 分鐘。

　　5. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，方法同步驟3。

　　6. 每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光孵育15 分鐘左右(根據(jù)實(shí)際顯**況酌情縮短或延長(zhǎng)，但不可超過(guò)30 分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí)，即可終止)。

　　7. 每孔加終止液 50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。

　　8. 立即用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD 值)。應(yīng)提打開(kāi)酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測(cè)程序。

　　9. 實(shí)驗(yàn)完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存。

　　人低密度脂蛋白(LDL)檢測(cè)試劑盒注意事項(xiàng)：

　　◆ 仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。

　　◆ 檢查試劑盒標(biāo)簽上的有效期。如果超過(guò)有效期，請(qǐng)勿使用。

　　◆ 按說(shuō)明書(shū)確定所有試劑齊全(數(shù)量、體積)。

　　◆ 標(biāo)本制備要規(guī)范，每份標(biāo)本體積要按2-3個(gè)復(fù)孔以上的量制備(貯存)，盡量分裝做備份。短期內(nèi)無(wú)法實(shí)驗(yàn)者，注意低溫保存。

　　◆ 準(zhǔn)備好所有實(shí)驗(yàn)額外所需物品，(比如移液器，試管，清洗器，酶標(biāo)儀)。

　　◆ 按說(shuō)明書(shū)將所用試劑平衡至室溫，根據(jù)檢測(cè)標(biāo)本數(shù)量確定所需試劑的量。

　　◆ 檢查試劑盒內(nèi)每種試劑的貯存條件，所有試劑均按照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)推薦的條件存儲(chǔ)。

　　◆ 檢查不穩(wěn)定或者變質(zhì)的試劑溶液(比如沉淀或變色)。有些試劑，比如標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液或者檢測(cè)稀釋液，可能在設(shè)計(jì)時(shí)就含有沉淀物。所有試劑在滴入酶標(biāo)板之，必需充分混勻。而由于沉淀物的特性，在加入酶標(biāo)板之，必需不停攪拌。

　　◆ 充分的孵育時(shí)間和溫度。

　　◆ 切勿使用不同生產(chǎn)批號(hào)的試劑取代現(xiàn)有試劑或混合現(xiàn)有試劑。

　　◆ 在混合或溶解蛋白溶液時(shí)，避免泡沫產(chǎn)生。

　　◆ 在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之，安排好實(shí)驗(yàn)流程。

　　◆ 在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之，清潔工作臺(tái)。

　　◆ 若有問(wèn)題，應(yīng)與我公司或代理商的技術(shù)支持聯(lián)系

　　結(jié)果判斷:

　　1. 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。亦可以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　2. 推薦使用業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù);亦可將樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

　　3. 若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

　　人低密度脂蛋白(LDL)檢測(cè)試劑盒靈敏度、檢測(cè)范圍、特異性和重復(fù)性:

　　●靈敏度：小可測(cè)：0.35ng/mL

　　●檢測(cè)范圍：0.781-50ng/mL

　　● 重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%。

　　● 特異性:可檢測(cè)重組或天然的人低密度脂蛋白(LDL)，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。

　　操作概要

　　1. 在各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品各 100μL， 37℃孵育 90 分鐘

　　2. 倒去孔內(nèi)液體，加入 100μL 生物素化抗體工作液，37℃孵育 60 分鐘

　　3. 洗滌 3 次

　　4. 加入 100μL 酶結(jié)合物工作液， 37℃孵育 30 分鐘

　　5. 洗滌 5 次

　　6. 加入 90μL 底物溶液， 37℃孵育 15 分鐘左右

　　7. 加入 50μL 終止液，立即在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)量 OD 值

　　8. 結(jié)果計(jì)算

　　問(wèn)題分析

　　若實(shí)驗(yàn)效果不好，請(qǐng)及時(shí)對(duì)顯色結(jié)果拍照，保留所用板條及未使用試劑，并妥善保存，然后

　　聯(lián)系我公司技術(shù)支持為您解決問(wèn)題。

　　我是按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行測(cè)定的，但是沒(méi)有任何信號(hào)，為什么?

　　◆ 對(duì)于使用HRP底物的比色測(cè)定，終止液的加入會(huì)使底物變色。而說(shuō)明書(shū)推薦的波長(zhǎng)就是適波長(zhǎng)。

　　◆ 通過(guò)輕拍酶標(biāo)板的邊緣充分混合孔內(nèi)試劑。加入終止液的時(shí)，顏色由藍(lán)變黃(如果是HRP

　　底物)。如果加終止液之孔內(nèi)試劑沒(méi)有混合，則底物顏色變綠。

　　◆ 可能加入試劑的順序錯(cuò)誤。

　　◆ 加入底物溶液以后不要清洗酶標(biāo)板。

　　◆ 在連續(xù)稀釋時(shí)確定已經(jīng)加入標(biāo)準(zhǔn)品。

　　◆ 如果底物系統(tǒng)中有兩個(gè)成分，則必需混合均勻。

　　◆ 確定酶標(biāo)儀的使用和操作正確。

　　◆ 確定試劑，標(biāo)準(zhǔn)品，樣品都正確配制并按照說(shuō)明滴加無(wú)誤。

　　◆ 對(duì)于高敏感性試劑盒，確定使用的底物和放大劑都正確稀釋。

　　人低密度脂蛋白(LDL)檢測(cè)試劑盒本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的不斷提升。公司在經(jīng)營(yíng)中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴(yán)于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)，以過(guò)硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來(lái)維護(hù)和拓展市場(chǎng)，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們?cè)概c您真誠(chéng)合作，共創(chuàng)美好的未來(lái)。